領(lǐng)學(xué)術(shù)科研之先，創(chuàng)食品科技之新
—— 中國食品雜志社
針對副溶血性弧菌主要毒素編碼基因（tdh和trh），基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，以毛細(xì)管為反應(yīng)介質(zhì)，建立一種微量（5 μL）、特異、靈敏、低成本、可視化、快速檢測的毛細(xì)管LAMP（capillary LAMP，cLAMP）。本研究針對每個靶標(biāo)基因分別設(shè)計6 條特異性引物，系統(tǒng)優(yōu)化Mg2＋、dNTPs濃度和Bst DNA聚合酶使用量，以及反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度等參數(shù)，確立最適cLAMP反應(yīng)體系；測定該方法的靈敏度和特異性。結(jié)果表明：優(yōu)化后的5 μL cLAMP反應(yīng)體系為6 mmol/L或8 mmol/L Mg2＋，1.44 mmol/L或1.28 mmol/L dNTPs、0.096 U/μL Bst DNA聚合酶、反應(yīng)溫度65 ℃、反應(yīng)時間60 min。針對靶基因tdh和trh，cLAMP方法檢測副溶血性弧菌基因組DNA的最低檢測限分別為3 fg/μL和34 fg/μL，純培養(yǎng)物的最低檢測限分別為9.85×103 CFU/mL和8.25×105 CFU/mL；且與其他6 種常見致病菌（霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）均無交叉反應(yīng)。本研究建立的微量、可視化cLAMP方法為食源性致病菌副溶血性弧菌檢測試劑盒的研發(fā)提供了技術(shù)支撐。
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