領(lǐng)學(xué)術(shù)科研之先，創(chuàng)食品科技之新
—— 中國食品雜志社
目的：采用逆轉(zhuǎn)錄微滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction，RT-ddPCR）技術(shù)和QX200 Droplet Digital PCR System，建立一步法RT-ddPCR高靈敏快速檢測(cè)生菜中GII型諾如病毒（norovirus genegroup II，NoV GII）的方法。方法：優(yōu)化RT-ddPCR檢測(cè)NoV GII的反應(yīng)體系；通過10?倍梯度稀釋的NoV GII線性陽性質(zhì)粒確定RT-ddPCR的檢測(cè)范圍；利用其他常見的腸道病毒核酸（非GII型諾如病毒）作為反應(yīng)模板，與NoV GII核酸同時(shí)進(jìn)行RT-ddPCR，判定反應(yīng)體系的特異性，并通過不同時(shí)間多次檢測(cè)樣品的方式判斷該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。采用ISO/TS 15216-1:2013食品中諾如病毒RNA提取方法，對(duì)人工染毒不同水平（高、中、低）的NoV GII生菜樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)研究去除抑制物前后對(duì)RT-ddPCR檢測(cè)的影響，并與逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）進(jìn)行檢測(cè)回收率的對(duì)比，探究RT-ddPCR在食品中NoV?GII快速與定量檢測(cè)上的發(fā)展?jié)摿εc應(yīng)用前景。結(jié)果：RT-ddPCR的最高檢測(cè)限為8.47×104?copies/μL，最低檢測(cè)限為2.12?copies/μL，RT-ddPCR擴(kuò)增效率為95.44%，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.997?3。在不同濃度人工染毒生菜樣品中，抑制物的存在對(duì)ddPCR回收率檢測(cè)結(jié)果沒有顯著性差異。在高、中染毒濃度下，抑制物對(duì)RT-qPCR與RT-ddPCR回收率檢測(cè)結(jié)果影響不顯著。低濃度下，未去除抑制物的RT-qPCR法平均回收率僅1.43%，與去除抑制物后的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果（平均回收率為9.71%）有顯著差異，且與RT-ddPCR的檢測(cè)結(jié)果（未去除抑制物的RT-ddPCR平均回收率為11.80%，去除抑制物后平均回收率為12.53%）存在顯著性差異。結(jié)論：生菜抑制物對(duì)RT-ddPCR的檢測(cè)影響不顯著，利用RT-ddPCR可有效測(cè)出低濃度的受污染樣品，避免用現(xiàn)有的RT-qPCR方法因抑制物帶來的“假陰性”檢測(cè)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)建立的RT-ddPCR方法能高效、靈敏地檢測(cè)出受污染食品中NoV?GII的低病毒含量，在食源性病毒檢測(cè)中具有可觀的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。
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